​饮用水安全：可同化有机碳（AOC）检测方法的对比

为了实现快捷、准确、灵敏、易于操作地测定水中AOC的浓度，评价异养细菌在水中的再生长潜力，为研究饮用水生物稳定性、保障饮用水生物安全提供技术支撑，本文将流式细胞术与原水土著细菌接种联用的AOC新型检测方法与传统的平板涂布法进行对比，提出了AOC检测的优化方法。

试验方法

试验仪器与材料

选用实验室已有的P17和NOX作为纯菌菌种，利用SYBR Green I单染+流式细胞术进行计数的同时，进行了平板涂布法的计数，对比两种计数方法得到的结果。土著细菌来自南方某供水系统使用的水源水。采集的水源水样过2μm滤膜，装于棕色广口瓶中，于22℃培养箱中培养5 d至稳定期后使用。纯菌培养在经过550℃马弗炉烘烤6 h后的硼硅玻璃样品瓶中进行，培养基使用LLA培养基：3.0 g牛肉膏、5 g氯化钠、5.0 g蛋白胨、15 g琼脂粉、1 L去离子水。

传统AOC检测方法——异养菌平板涂布计数法

AOC的传统测定方法以P17和NOX为测试菌种，接种至乙酸钠标准基质中，生长至稳定期后，对平皿计数细菌。根据乙酸钠浓度和此浓度下P17菌达到生长稳定期的数量进行标准曲线绘制，求出产率系数，实现对实际水样中测得的P17菌落数目的转化。本研究采取先后接种法，具体检测方法参考文献[12]。

流式细胞术测定AOC

利用荧光染色+流式细胞术计数，实现对饮用水中多项生物类指标的计数，包括总细胞浓度（total cell concentrations，TCC）、完整细胞浓度（intact cell concentrations，ICC）、AOC和细菌再生长潜力（bacteria regrowth potential，BRP）。

在测定AOC时，采用SYBR Green I单染+流式细胞术计数。SYBR Green I染料可以将所有的细胞染色，包括活着可培养的细胞、活着但不可培养的(VBNC)细胞和死细胞，具体方式如下。（1）SYBR Green I工作储备液的配置：取5μL SYBR Green I染料于灭菌后5 mL的塑料离心管中，加入495μL已经过0.22μm滤头过滤的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，制成SYBR Green I工作储备液，置于-20℃冰箱中保存。（2）待测细菌样品的制备：将待测水样在振荡器上震荡5 s，使细菌细胞分布均匀。无菌环境下取500μL样品于流式管中，将流式管置于37℃培养箱中预热5 min。（3）荧光染色：测定AOC时，避光加入5μL SYBR Green I工作储备液于待测细菌中。利用振荡器振荡5 s使染色均匀。（4）孵化与反应：将样品置于37℃培养箱中避光培养20 min，使细菌的染色充分和均匀。（5）流式细胞仪测样：使用BD FACS Verse流式细胞仪进行进样分析，采用488 nm（20 mW）的激发光，通道FL1采用527 nm的FITC通道，通道FL3采用700 nm的7-AAD通道。

结果与讨论

平板涂布计数、流式细胞术与流式细胞术+土著细菌接种的产率系数对比分析

图1（a）~图1（c）分别为利用平板涂布法（土著细菌采用浇板方式）和流式细胞术对P17、NOX和土著细菌在不同标准乙酸碳培养条件下计数后所绘制的标准曲线。乙酸碳梯度为0、25、50、75、100、150、200、250μg/L。拟合曲线斜率即3种接种菌对应的产率系数。

图1 P17、NOX和土著细菌的产率系数(a)P17；(b)为NOX；(c)土著细菌

表1总结了已有研究中P17和NOX的产率系数，本试验经多次测定所得到的产率系数平均值如表2所示。本试验中P17和NOX的产率系数与前人研究结果较接近。土著细菌的产率系数略大于P17的产率系数。由表2可知，土著细菌的平板计数线性拟合结果不理想。一方面，自然水体中的土著细菌是失活的或是不可培养的；另一方面，自然水体中的土著细菌所需的有机碳类型丰富多样，在乙酸碳培养基上进行培养，部分细菌竞争，使得平板计数不能正确表征结果，这间接表明无法使用土著细菌接种进行平板涂布法培养。

表1已有研究所测得的P17和NOX的产率系数

表2本试验所得产率系数

流式细胞术与平板涂布计数AOC检测值对比

图2对在产率系数计算中，平板计数法和流式细胞术两种计数方法所得的不同标准乙酸碳梯度培养下的细菌数进行了线性分析。二者所得线性拟合曲线斜率分别为1.15（R2=0.891）、0.84（R2=0.881）、1.31（R2=0.751）。P17纯菌的流式细胞术计数结果比平板计数法要高，这是因为平板计数法仅可检测可培养的活细菌，对于在代谢繁殖过程中已经死亡的细菌无法计数。与之相反，SYBR Green I将所有的细菌细胞都进行了染色，因此，SYBR Green I+流式细胞术可以检测水体中所有的细菌，流式细胞术计数的AOC检测值高于平板涂布计数法。这克服了传统平板涂布法仅可检测水中活的且可培养的细菌的缺陷。采用流式细胞术计数的NOX细菌值的结果偏低，可能是因为NOX细菌的尺寸较小（0.25~1.7μm），部分尺寸较小的细菌互相黏合，对测定结果产生影响。由2.1的结果可知，使用土著细菌接种、平板涂布法计数所得标准曲线R2低，线性不理想，因此，两种计数方法所得土著细菌线性拟合曲线R2同样较低。总体来说，流式细胞术测定的P17、NOX和土著细菌产率系数线性较好，可以认为，流式细胞术计数的细胞数与平板计数的细胞数具有正相关性，这表明将流式细胞术计数运用于AOC测定是切实可行的。本试验的结果表明，可以利用原水中土著细菌接种代替P17和NOX细菌接种，实现对水体中可同化有机碳的充分利用，解决了先后接种法存在的AOC测定值偏高的问题，缩短了检测时长（P17、NOX接种需7 d，而土著细菌接种只需5 d）。

图2 P17、NOX和土著细菌的流式细胞术测定结果与平板计数结果对比

AOC流式+土著与AOC流式+P17+NOX的相关性

流式细胞术（FCM）+纯菌接种与流式细胞术+土著菌接种两种检测AOC方法的主要差异在接种细菌上。本研究在南方某供水系统布设取样点采集水样，包括净水厂构筑物出水及实际给水管网片区，共17个采样点，采样为期一年。计数方法采用流式细胞术法，分别接种土著细菌和P17+NOX，连续检测一年水样中AOC的浓度，对比纯菌接种和土著细菌接种两种方法所测AOC的差异。对供水系统各采样点一年以来所有水样AOC流式+土著和AOC流式+P17+NOX的测定结果进行统计分析，建立AOC流式+土著和AOC流式+P17+NOX（R2=0.463，p<0.01）的关系，如图3所示。拟合结果表明，拟合曲线斜率为0.819＜1，说明AOC流式+土著的结果较AOC流式+P17+NOX偏低，可能是因为试验中P17、NOX采用先后接种法，NOX接种后可利用的营养物质包含了巴氏灭菌时死亡的P17菌体，导致AOC的测定结果偏高，即将死亡的P17菌体计入AOC是AOC流式+土著与AOC流式+P17+NOX相关性并不显著的重要原因之一。此外，采样点包括从原水、水厂各处理工艺、管网直到用户的整个供水系统，水样中有机物种类含量变化较大。P17和NOX利用水样中有机物的程度因实际水样中AOC类型、含量的不同而变化，因此，两种接种菌生长繁殖程度以及细菌数量在不同AOC水样中差异显著。加之，细菌培养本身不可控性，AOC流式+土著与AOC流式+P17+NOX之间的相关性并不显著。

图3 AOC流式+土著与AOC流式+P17+NOX的线性拟合结果

结论

本研究对比了平板涂布法、流式细胞术+纯菌（P17+NOX）接种与流式细胞术+土著细菌接种新型AOC测定方法，3种方法的优缺点如表3所示。由表3可知，相较于平板涂布法，土著细菌接种+流式细胞术所测得的AOC标准曲线线性关系较好，数据稳定，且可对水中的全部细菌进行计数，克服了传统平板涂布法仅可检测水中活的且可培养的细菌的缺陷。土著细菌所利用的有机物类型广泛，符合自然水体AOC组成，土著细菌接种+流式细胞术所表征的结果客观反映了水中细菌的存在状况，可为供水管理部门评判水质生物稳定性提供理论参考与技术支持。

表3 3种检测方法优缺点对比